簡要描述:Pikogreen dsDNA定量試劑盒(超敏)不同于常規(guī)的基于吸光度的測量,這款試劑盒可以區(qū)分dsDNA、ssDNA或RNA,有選擇性地檢測dsDNA(見圖1)。與傳統(tǒng)DNA定量方法相比,該產(chǎn)品具有檢測范圍廣、高靈敏度、高特異性等優(yōu)點(diǎn)。
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品牌 | 其他品牌 | 貨號(hào) | AN54L038/AN54L039 |
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規(guī)格 | 200 assays | 供貨周期 | 現(xiàn)貨 |
應(yīng)用領(lǐng)域 | 生物產(chǎn)業(yè) |
產(chǎn)品名稱 | 貨號(hào) | 規(guī)格 |
Pikogreen dsDNA定量試劑盒(超敏) | AN54L038 | 200 assays |
Pikogreen dsDNA定量試劑盒(超敏) | AN54L039 | 1000 assays |
產(chǎn)品組分
組分 | AN54L038 | AN54L039 |
A: Pikogreen High Sensitivity dsDNA Quantitation Solution | 50 mL | 250 mL |
B: Pikogreen High Sensitivity dsDNA Enhancer, 100× | 0.5 mL | 2.5 mL |
C: dsDNA Standards 0 , 0.5, 1, 2 ,4 ,6, 8 and 10 ng/uL dsDNA from calf thymus | 每組 0.1 mL(8組) | 每組 0.5 mL(8組) |
運(yùn)輸與保存
藍(lán)冰運(yùn)輸。4℃避光保存,有效期24個(gè)月。
使用方法
使用前,將產(chǎn)品從儲(chǔ)存條件下取出恢復(fù)至室溫。如果100XEnchancer儲(chǔ)存液出現(xiàn)沉淀,可37℃水浴溶解。每個(gè)組分應(yīng)充分震蕩或渦旋混勻、離心,以免造成不必要的試劑損耗。
每個(gè)待測樣品對(duì)應(yīng)200 μL的Pikogreen工作液。對(duì)于一個(gè)96孔板,吸取200 μL 100X Enchancer,加入到20 mL Quantitation Solution 中,渦旋混勻,配置成Pikogreen工作液,為得到最佳結(jié)果,工作液應(yīng)在1 h內(nèi)使用完畢。如果將工作液重新儲(chǔ)存并在24 h內(nèi)使用,結(jié)果的準(zhǔn)確性會(huì)有輕微損失。儲(chǔ)存過程中,增強(qiáng)液可能會(huì)出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象,可以通過渦旋震蕩使其重懸。
對(duì)于每個(gè)樣品,吸取200 μL的工作液至黑色的96孔板微孔中。為確保結(jié)果精確可靠,建議每個(gè)測試樣品和DNA標(biāo)樣分別做平行的3個(gè)復(fù)孔,此過程也可以使用有精確量程的移液排槍進(jìn)行。黑色的檢測板可以減少各測試樣品間的熒光干擾。
在96孔板微孔中,每孔加入10 μL的dsDNA標(biāo)樣或未知樣品,并用移液器輕輕混勻。
將微孔板室溫避光孵育5~10 min,為得到最佳結(jié)果,孵育結(jié)束后,應(yīng)立即讀取檢測板。也可以在6 h內(nèi)讀取數(shù)據(jù),但結(jié)果的精確性會(huì)有輕微損失。
使用激發(fā)波長和發(fā)射波長在485 nm和530 nm處的酶標(biāo)儀測量熒光值。
制作一條標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算檢測樣品的DNA濃度(見圖2)。
【注】:圖2標(biāo)準(zhǔn)曲線僅供參考,您可以根據(jù)實(shí)際測得的數(shù)據(jù)自制標(biāo)準(zhǔn)曲線,從而求算樣品的濃度。
圖1:使用Pikogreen High Sensitivity dsDNA 定量試劑盒檢測不同類型核酸得到的相對(duì)熒光強(qiáng)度 | 圖2:使用Pikogreen Hig Sensitivity dsDNA 定量試劑盒制作的calf thymus DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線(Ex/Em 485/530),左上角插圖顯示了低濃度DNA樣本測定的曲線圖。 |
注意事項(xiàng)
對(duì)于要檢測的植物或動(dòng)物來源的DNA樣本,小牛胸腺DNA(Calf thymus DNA )常常作為制作DNA標(biāo)樣的參照物。因?yàn)?/span>Calf thymus DNA具有雙鏈結(jié)構(gòu)、高度聚合,堿基分配均勻(AT含量58%,GC42%)。如果檢測樣品的熒光值超過了標(biāo)準(zhǔn)曲線,那么需要將樣品做進(jìn)一步稀釋處理。為了保持結(jié)果的一致性,務(wù)必使每孔上樣量均等,且不含有其他高濃度的污染物。
2. Pikogreen High Sensitivity dsDNA 定量試劑盒可以測量范圍在0.2~100 ng的dsDNA。對(duì)于一些不需要線性檢測的樣品,試劑盒檢測范圍可以擴(kuò)展至200 ng。如需檢測更低含量的樣品,您可以將DNA標(biāo)樣用1×TE緩沖液作進(jìn)一步的稀釋,濃度可以稀釋到0.02 ng/μL,然后按照常規(guī)程序每孔10 μL上樣。
3. 對(duì)于不同種類的檢測儀器,您可以優(yōu)化儀器設(shè)置,以獲取最佳線性度。一些可能會(huì)影響最終線性度和相對(duì)熒光強(qiáng)度的因素有:(1)激發(fā)和發(fā)射波長與帶寬(2)截止型濾波器(3)靈敏度設(shè)置(4)移液的準(zhǔn)確性(5)微孔板制造商。為了得到最佳結(jié)果,請(qǐng)使用精確校準(zhǔn)的移液器和去RNA酶的槍頭、試管以及檢測板。建議檢測時(shí)每個(gè)DNA標(biāo)樣和未知樣品都設(shè)定3個(gè)復(fù)孔。如果檢測時(shí)不只一塊96孔板,建議每塊96孔板都設(shè)定一條標(biāo)準(zhǔn)曲線,盡量減少檢測板之間的誤差。
表1:常見的DNA污染物對(duì) Pikogreen High Sensitivity dsDNA 定量試劑盒的影響
復(fù)合物 | 初始濃度 | 終濃度(200 μL) | 結(jié)果 |
醋酸銨 | 100 mM | 5 mM | Pass |
醋酸鈉 | 600 mM | 30 mM | Pass |
氯化鈉 | 200 mM | 10 mM | Pass |
氯化鎂 | 25 mM | 1.25 mM | Pass |
苯* | 2 % | 0.1 % | Pass |
乙醇 | 10 % | 0.5 % | Pass |
氯仿 | 2 % | 0.1 % | Pass |
十二烷基硫酸鈉(SDS) | 0.2 % | 0.01 % | Pass |
Triton X-100 | 0.2 % | 0.01 % | Pass |
牛血清白蛋白(BSA) | 200 mg/mL | 10 mg/mL | Pass* |
dNTPs** | 2 mM | 100 μM | Pass |
聚乙二醇 | 40 % | 2 % | Pass |
瓊脂糖 | 2 % | 0.1 % | Pass |
【注】:3份dsDNA平行樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線,分別在上述含有特定濃度污染物的條件下(初始濃度進(jìn)行檢測,“Pass"指與沒有污染物的體系相比較,實(shí)驗(yàn)結(jié)果變化范圍<20%。所有樣品用Molecular DevicesGemini XS酶標(biāo)儀在485 nm處激發(fā),在530 nm處測熒光強(qiáng)度?!?/span>Pass *"指由此條件測得的標(biāo)準(zhǔn)曲線有少許變動(dòng)。“dNTPs**"指dATP, dCTP, dGTP, dTTP的混合物。
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